展商预告 | 昭衍邀您参加BioCon2025，解读腺相关病毒载体基因治疗产品非临床评价关注要点

来源：市场资讯

（转自：商图药讯）

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昭衍新药确认出席第十二届国际生物药全生命周期技术年会（BioCon2025），欢迎各位行业伙伴莅临BioCon2025，并到我司展位（A02, A03）参观交流！

昭衍演讲预告

演讲嘉宾 | 曹洋，昭衍新药

演讲题目 | iPS细胞衍生细胞治疗产品的非临床研究策略和实战分析

所属论坛 | 免疫细胞治疗药物论坛

具体时间 | 7月3日，11:30-12:00

腺相关病毒载体基因治疗产品

非临床评价关注要点

基因治疗作为生物医药领域的颠覆性技术，正在为遗传性疾病、罕见病及难治性疾病带来突破性疗法。腺相关病毒（AAV）载体是临床试验中使用最多的病毒载体之一，已有多款AAV基因治疗药物获批上市。本文将简要阐述AAV治疗药物的研究进展、风险分析以及非临床研究的关注要点，为该类产品的药理毒理评价提供参考建议。

一． AAV基因治疗药物概述

体内基因治疗产品一般选用适当的载体或转染方式将外源基因（或基因编辑工具）导入人体，通过替代、补偿、阻断、修正特定基因以达到治疗疾病的目的。选择合适的载体对于携带特定目的基因并高效递送至靶标器官/组织至关重要。常见的病毒载体主要有腺病毒（AdV）、腺相关病毒（AAV）、慢病毒（LV）、逆转录病毒（RV）、疱疹病毒（HSV）。其中，AAV载体凭借其理化性质稳定、致病性弱、较低的免疫原性和整合风险、目的基因表达持久等优势，成为体内基因治疗的首选递送工具。

AAV是目前发现结构最简单的、无包膜单链DNA病毒，由蛋白衣壳（capside）和长度4.7kb的单链DNA基因组构成。AAV基因组两端为末端反向重复序列（ITR），是病毒DNA复制的起点和触发病毒包装的信号。两端ITR中间含有2个基因，分别是Cap和Rep基因。其中Cap编码的是病毒衣壳的结构蛋白，Rep编码的是病毒复制和包装所需要的复制酶。

重组腺相关病毒（Recombinant AAV，rAAV）是工程改造的AAV载体，只在两端保留作为包装信号的ITR，删除AAV基因组全部编码蛋白Rep或Cap基因序列，并且添加治疗性基因表达盒。用于基因疗法载体的重组腺相关病毒携带的蛋白衣壳与野生型AAV几乎完全相同，然而基因组中编码病毒蛋白的部分完全被治疗性转基因替代，使其具有较低的免疫原性和细胞毒性。

图1 野生型AAV和重组AAV载体基因组示意图

AAV进入机体后与靶细胞表面受体结合，然后内吞作用进入细胞。通过核孔进入细胞核的病毒释放出单链基因组并复制形成双链结构，然后持续进行基因表达（见图2）。

图2 AAV基因治疗产品的作用机制

目前已知AAV至少有13种血清型和多种不同的变体，具有不同的组织嗜性（见表1）。人体对AAV的高易感性导致约40%~80%人群存在抗AAV抗体，但目前公认AAV对人类无致病性。

表1 人类天然AAV受体和组织特异性总结

二． AAV基因治疗药物研发进展

自2012年欧盟批准Glybera成为首个正式上市的AAV基因疗法药物，目前全球已有9款AAV基因治疗药物获批上市，包括国内1款用于治疗B型血友病的治疗产品（见表2）。此外，全球范围内还有数百款以AAV作为病毒载体的基因治疗药物处于临床研发阶段，适应症涉及眼科、中枢神经系统、肝脏、血液系统、心血管系统和肌肉等。

表2 全球范围上市的AAV载体基因治疗药物

三． AAV载体的风险分析

尽管AAV载体是目前已知安全性较好的病毒载体，但病毒本身会激活免疫系统，仍不可避免地带来一些不良反应。在过去几年中，与AAV疗法安全性相关的报道频出，FDA也因安全性问题叫停了多项AAV基因疗法的开发。上市AAV类产品和已开展的临床研究中较为常见的一些临床不良反应，汇总于表3和表4。

表3 已上市AAV载体基因治疗药物临床不良反应

FDA于2021年9月专门召开了专家委员会会议，重点讨论了“常见的”基因治疗中可能的安全风险，尤其关注到腺相关病毒AAV。

1）肝脏毒性

基因疗法所致的肝脏毒性在临床试验中较为常见，主要表现为肝酶水平升高和肝脏损伤。肝脏毒性的产生可能与细胞毒性T细胞对转染肝细胞的免疫反应相关（见图3，来源于FDA官网），不过患者治疗前的肝脏基础状态也会影响到肝脏毒性的发生。

图3 AAV产品肝脏毒性的相关机制

2）致癌性和整合

AAV载体进入细胞之后，携带的转基因通常不会整合到细胞的基因组中。在小鼠模型以及狗的血友病A模型中，发现少量AAV载体的基因组会整合到宿主的DNA中；在非人灵长类动物实验和人临床试验中，尚未发现AAV基因组整合导致的致癌情况。

FDA专家委员会建议在动物研究中应当进行更为长期的研究，在人类进行长期的随访，采取新方法和新技术检测AAV对基因组的改变等。

3）血栓性微血管病（TMA）

血栓性微血管病（TMA）是一种血液学急症，由于微小的血块堵住了毛细血管和小血管，导致贫血、血小板降低和器官损伤（主要为肾损伤）。治疗脊髓性肌萎缩症和杜氏肌营养不良的临床试验中均发现了TMA，先天免疫系统的补体通路过度激活可能是导致TMA的原因（见图4，来源于FDA官网）。

图 4 TMA作用机制

4）神经毒性

背根神经节损伤主要表现为单个核细胞浸润、卫星胶质细胞增殖和神经元变性，在非人灵长类的非临床研究中可见较多的报道，但没有观察到相关联的神经行为异常。此外，脑部途径给药所致的脑组织异常改变也是较为常见的不良反应。

四． AAV基因治疗药物非临床评价

如前所述，全球已有9款AAV基因治疗药物获批上市，汇总具有代表性的国外5个AAV上市药物的非临床研究开展情况（见表5）。

表5 已上市AAV治疗药物非临床研究开展情况

根据上表信息可以得知，AAV基因治疗药物非临床评价主要包括药效学研究、组织分布研究和毒理学研究。安全药理学、遗传毒性、致癌性和局部耐受性一般不需要开展或伴随一般毒理学研究进行。生殖毒性研究取决于生殖器官中是否检测到载体分布和临床预期人群。如果性腺有持续表达并涉及生育可能人群，需进行生殖系传播和生殖发育研究。

1）非临床研究指导原则

NMPA分别在2021和2024年发布了基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行版）和腺相关病毒载体基因治疗产品非临床研究技术指导原则。FDA和EMA也都颁布了相关的指导原则（见图5）。此外，ICH S12是针对基因治疗产品非临床生物分布研究的指导原则。

图5 FDA和EMA 基因治疗产品相关指导原则

2）非临床研究总体策略

2.1 研究目标

非临床研究是AAV产品从实验室走向临床的核心桥梁，其核心目标包括：① 概念验证（POC）：验证AAV载体能否有效递送目的基因、实现靶组织表达并产生治疗效应。② 体内药代特征：评估AAV载体产品的生物分布、存续时间、脱落特征。③ 风险评估：根据动物试验中发现的潜在风险，阐明毒性反应特征，确定临床监测指标，为临床风险控制提供依据。④ 剂量探索与转化支持：确定最低有效剂量（MED）、最大耐受剂量（MTD），支持首次人体试验（FIH）剂量设计。

2.2 受试物

应能代表临床拟用产品，明确受试物质量特性。使用与临床批次相同的方法测定AAV载体滴度。关注关键杂质，包括空壳病毒（无基因组AAV）、游离衣壳蛋白、宿主细胞DNA等。若生产工艺变更，需开展桥接研究，对比变更前后产品的杂质谱与安全性，或开展新的非临床研究。

2.3 动物种属选择

选择相关动物种属，是非临床研究的重点，主要从以下几个方面考虑：

生物学/生理学/给药方式相关性：① AAV感染效率：不同血清型AAV在动物中感染敏感性、组织趋向性、转导效率与人的相似性。② 目的基因表达：目的基因转录和表达可行性及其表达产物的生物学效应与人的相似性。③ 解剖学/生理学特征。④ 给药方式和给药器械可行性。

免疫状态：野生型AAV在人群中普遍存在预存免疫，动物试验需筛选低中和抗体滴度个体。若使用免疫正常动物，可联合免疫抑制剂（如糖皮质激素）以模拟临床患者的免疫调控，但需关注免疫抑制剂本身可能带来的毒性反应。

多种属验证：啮齿类（成本低）+ 非人灵长类（转化价值高，更能反应人体情况）联合研究。关注不同种属、不同年龄的动物对毒性反应的差异。仅采用一种动物种属时，应提供合理的科学依据。

疾病模型的应用价值（药效-毒性整合评价）：疾病模型可同步评估AAV的治疗效应与病理状态下的毒性风险。整合设计有助于阐明药效、药代和毒理的相关性。

幼龄动物试验的特殊要求：针对儿科适应症（如SMA、先天性失明），需开展幼龄动物毒理学试验。选择与人类发育阶段匹配的动物年龄（如新生鼠对应婴儿期）开始给药，并长期持续观察，以覆盖人类发育的幼年和成年阶段。关注AAV对生长发育、神经行为、生殖器官的长期影响。

3）非临床研究的关注要点

3.1 药效学研究

体外研究：进行转导效率和表达产物功能的验证，通过细胞模型（如HEK293、原代肝细胞）评估AAV载体对靶细胞的感染能力。也需要检测目的蛋白活性（如凝血因子促凝活性、酶替代治疗的底物代谢率）。

体内研究：根据不同适应症选择合适的动物模型，多数为转基因动物模型。给药途径需要确保供试品能达到靶部位/组织/细胞。采用qPCR、Western Blot等技术定量分析目的基因在靶器官的表达水平。在疾病模型中观察临床终点改善情况（如血友病模型的出血时间缩短、SMA模型的运动功能提升）来评估有效性潜力。

量效关系：验证最低有效剂量（MED），高剂量采用最大可行剂量（MFD），受限于制剂浓度、给药体积（如玻璃体注射需≤100μL）。

种属间剂量换算：全身给药（如静脉注射），按照vg/kg体重折算。如果局部组织给药，考虑用腔体面积或体积进行剂量折算。

3.2 药代动力学研究

3.2.1 组织分布

通过生物分布研究来考察AAV载体产品的靶向和非靶向特征及其风险，考察目的基因及其表达产物的存续性。采用相关动物，每个性别/组/时间点至少评估5只啮齿类动物或3只非啮齿类动物。可单独开展，也可伴随药效学试验和/或毒性试验进行。

组织采样清单及检测（参考ICH S12）：必检组织为血液、给药部位、肝脏、脾脏、性腺、脑、心脏、肾上腺、脊髓、肾脏、肺脏、肌肉等。

补充组织：根据AAV血清型补充（如AAV9需增加脊髓、背根神经节）；根据给药途径补充（如眼部途径增加眼组织，脑内给药增加脑部和神经组织等）。

检测方法需进行方法学验证。载体DNA定量使用ddPCR和qPCR，表达产物分析使用ELISA和IHC等。

不同给药途径的分布特性：血管内注射是最常用的途径，一般全身组织都可见分布（包括性腺）；用于中枢神经系统递送的方式（脑室内注射、大脑实质注射、鞘内注射）需重点关注神经组织和脑组织，眼底给药（视网膜下、玻璃体内、脉络丛注射）主要分布在眼局部。

3.2.2 病毒脱落分析

检测样本类型为尿液、粪便、唾液、泪液（眼科给药）。时间点包括密集采样期（给药后1-7天）和长期跟踪（至载体清除）。对照组动物也建议进行检测。

复制型AAV（rcAAV）和呼吸道给药（飞沫传播风险）认为是高风险。局部给药（如玻璃体内注射）认为是低风险。

3.3 一般毒理学试验设计

试验分组：对照组包括溶媒对照、空载体对照（识别衣壳蛋白毒性）、非功能基因载体对照（排除目的基因非特异性效应）等。给药组应包括多个剂量组，有助于评估毒性反应-剂量关系。

给药剂量：高剂量通常为临床拟用剂量的10倍，当难以达到这个剂量时，可选用最大可行剂量（MFD）。

观察时间：在生物分布高峰时间点或毒性明显的时间点安乐死动物。当AAV载体在体内存续时间>6个月，或目的基因产物具促增殖活性，需要长期跟踪表达持续性（≥6个月，可设置多个解剖时间点），评估AAV载体在靶组织的存续能力。

观察指标：常规指标包括体重、摄食量、血液学、血液生化、组织病理学，同时伴随安全药理评估。特殊指标考虑：免疫毒性包括细胞因子、淋巴细胞亚群分析等；脑内给药需增加神经行为学观察和测试；眼底给药需增加眼部行为和功能检查。免疫原性评估需动态监测抗AAV抗体、抗表达产物抗体。此外还需要关注细胞免疫情况，评估CD8+T细胞对转导细胞的攻击风险。

3.4 生殖毒性

生殖系传播风险：关注AAV载体产品是否在性腺表达。若性腺有载体持续存在时，需进一步研究生殖细胞载体分布（主要是精子和卵母细胞，必要时也考虑性腺其它细胞）和F0至F1代载体分布（繁育试验，可结合生殖和发育毒性试验开展）。

关注AAV载体产品的临床目标人群：评估载体是否从F0代传递到F1代，考虑开展父系生殖系传播（目标人群仅为男性）、双性别生殖系传播（涉及生育可能人群）。当明确为不育人群，可不开展相关研究。

生殖和发育毒性：涉及生育可能人群时，若适应症适用于双性别，生殖I段（生育力和早期胚胎发育毒性试验，FEED）、II段（胚胎-胎仔发育毒性试验，EFD）和III段（围产期发育毒性试验，PPND）毒性试验均考虑开展。若适应症仅适用于男性，开展I段生殖试验，无需开展II段和III段生殖试验。

3.5 遗传毒性、致癌性与整合风险

整合位点分析：如果是新型载体，如需评价整合风险，可在组织分布或毒性试验中保留组织进行测序分析，可采用线性扩增介导的PCR（LAM-PCR）、高通量测序（NGS）等。若>1%的整合事件位于癌基因附近（如MYC、BCL2），可能被认为是高风险。

致癌性：一般无需开展，多采用证据权重法（WoE）分析。

遗传毒性：一般无需开展。

3.6 制剂安全性

根据产品特点和临床应用情况，开展临床制剂的刺激性和溶血性试验。

结语

AAV载体基因治疗的非临床评价是一项高度复杂的系统工程，需整合多学科技术、遵循动态风险评估原则，分阶段逐步推进。基于AAV产品的特点，通过科学设计、技术创新与全生命周期管理，可最大化降低临床开发风险，加速突破性疗法上市进程。

参考文献

【1】腺相关病毒载体基因治疗产品非临床研究技术指导原则，国家药品监督管理局药品审评中心，2024年12月

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